LC-MS in der Peptidanalyse

Eine Reinheitsangabe beantwortet, wie einheitlich eine Probe ist. Sie beantwortet nicht, ob überhaupt die richtige Verbindung vorliegt. Diese zweite Frage gehört in die Massenspektrometrie. Diese Seite erklärt, wie LC-MS funktioniert, was ein Massenspektrum über ein Peptid aussagt und wo die Methode an Grenzen stößt.

Zwei Verfahren in einem Gerät

LC-MS ist eine Kopplung. Der erste Teil, die Flüssigchromatographie, trennt die Probe auf, sodass die Komponenten nacheinander die Säule verlassen. Der zweite Teil, die Massenspektrometrie, übernimmt den Säulenausgang und bestimmt für jede eluierende Komponente das Masse-zu-Ladung-Verhältnis.

Der Gewinn liegt in der Zuordnung: Man erhält nicht nur die Information, dass zu einem bestimmten Zeitpunkt etwas eluiert, sondern auch, welche Masse dieses Etwas besitzt. Ein Peak im Chromatogramm bekommt damit eine chemische Zuordnung statt nur einer Retentionszeit.

Ionisation: wie ein Peptid in die Gasphase kommt

Peptide sind groß, polar und nicht flüchtig. Damit sie massenspektrometrisch erfasst werden können, müssen sie schonend ionisiert und in die Gasphase überführt werden. In der Peptidanalytik ist die Elektrospray-Ionisation (ESI) das Standardverfahren: Der Flüssigkeitsstrom wird an einer Kapillare unter hoher Spannung vernebelt, das Lösungsmittel verdampft, zurück bleiben geladene Molekülionen.

Ein Merkmal von ESI ist die Mehrfachladung. Peptide nehmen häufig mehrere Protonen auf und erscheinen deshalb nicht als einzelnes Signal, sondern als Serie von Signalen mit unterschiedlicher Ladungszahl. Aus dieser Serie wird die tatsächliche Molekülmasse rechnerisch rekonstruiert, ein Schritt, der als Dekonvolution bezeichnet wird.

Ein Signal bei m/z 800 kann ein einfach geladenes Molekül von etwa 799 Da sein oder ein dreifach geladenes von etwa 2397 Da. Erst die Betrachtung der gesamten Ladungsserie und ihrer Abstände erlaubt die eindeutige Zuordnung. Ein Massenspektrum ohne Angabe der Ladungszahl ist deshalb nur eingeschränkt interpretierbar.

Der Abgleich mit der berechneten Masse

Aus der Aminosäuresequenz lässt sich die theoretische Molekülmasse exakt berechnen. Der Vergleich mit dem gemessenen Wert ist der eigentliche Identitätsnachweis. Vier Begriffe sind dafür zu unterscheiden:

Monoisotopische Masse – Masse mit den jeweils häufigsten Isotopen jedes Elements. Bei hochauflösenden Geräten üblich.
Mittlere Masse – über die natürliche Isotopenverteilung gemittelt. Bei Geräten geringerer Auflösung üblich.
Berechnete Masse – aus Summenformel oder Sequenz abgeleitet, im Bericht meist als calculated oder theoretical bezeichnet.
Gemessene Masse – aus dem Spektrum rekonstruiert, meist als found oder observed bezeichnet.

Eine Gegenüberstellung von berechnet und gefunden ist erst dann aussagekräftig, wenn klar ist, ob monoisotopische oder mittlere Massen gemeint sind. Werden die Bezugsgrößen vermischt, entstehen scheinbare Abweichungen, die reine Darstellungsprobleme sind. Die Angabe in ppm bezeichnet die relative Massenabweichung: 5 ppm bedeuten bei 2000 Da eine absolute Differenz von 0,01 Da.

Was LC-MS nicht beantwortet

Isobare Spezies. Verbindungen gleicher Masse, aber unterschiedlicher Struktur, etwa Epimerisierungsprodukte oder vertauschte Sequenzabschnitte, sind über die Masse allein nicht unterscheidbar. Hier hilft die chromatographische Trennung oder eine Fragmentierung (MS/MS).
Mengen. Die Signalintensität hängt stark von der Ionisierbarkeit der jeweiligen Substanz ab. Ein Massenspektrum ist ein Identitätsinstrument, kein Mengeninstrument.
Nicht ionisierbare Bestandteile. Salze, Wasser und einige Gegenionen liefern kein verwertbares Signal.
Die vollständige Sequenz. Eine übereinstimmende Masse bestätigt die Summenformel innerhalb der Messtoleranz. Sequenzvarianten mit identischer Zusammensetzung besitzen dieselbe Masse; ein Sequenznachweis erfordert Fragmentierungsexperimente.

Häufige Fehlinterpretationen

Aus der Signalhöhe auf den Mengenanteil zu schließen.
Eine passende Molekülmasse als Sequenzbeweis zu werten.
Monoisotopische und mittlere Masse gegeneinander zu vergleichen.
LC-MS als Ersatz für die chromatographische Reinheitsbestimmung zu betrachten. Die Reinheitsangabe wird weiterhin aus dem Flächenverhältnis abgeleitet.

Dokumentationskontext

Ein massenspektrometrisches Ergebnis ist nur so belastbar wie seine Dokumentation. Nachvollziehbar wird es, wenn Ionisationsverfahren, Massenbezug, berechnete und gemessene Masse sowie eine Toleranzangabe vorliegen und die Messung erkennbar an derselben Charge erfolgte wie die übrigen Prüfungen. Wie ein Analysenzertifikat abschnittweise gelesen wird, beschreibt COA richtig lesen. Die Verknüpfung zwischen Dokument und Gebinde behandelt Chargenprüfung und Rückverfolgbarkeit. Chargenbezogene Unterlagen werden unter Analytik & Zertifikate veröffentlicht, soweit entsprechende reale Dokumente vorliegen.